原發登革熱IgG間接法檢測試劑
Panbio Dengue IgG Indirect ELISA
產品目錄號01PE30
預期用途
Panbio Dengue IgG Indirect ELISA用于定性檢測登革熱病原血清型（1、2、3和4）血清中的IgG抗體，輔助臨床實驗室診斷出現臨床癥狀或既往感染登革熱病毒的患者。
概述
蟲媒病毒中的登革熱屬通過蚊子傳播，主要是埃及伊蚊和白紋伊蚊。 登革熱病毒感染，與傷寒病有關，其特征是突然發熱、劇烈頭痛、肌痛、關節痛和皮疹。 登革熱感染的嚴重并發癥包括登革出血熱和登革休克綜合征。此類并發癥的發病率增加與繼發性感染不同登革熱血清型有關。
通過ELISA對四種登革熱血清型的IgG類特異性抗體進行檢測，是一種診斷既往感染登革熱病毒的患者的重要方法。 配對血清中IgG， 水平不斷升高是活動性登革熱感染的表現。傳統上，血凝抑制試驗（HAI）滴度被用于劃分原發性或繼發性感染。當前的界定方法是采用及時分離至少7天的配對血清標本檢測，急性標本的HAI滴度≥ 1:2560被認為患者感染了繼發性黃病毒1。
檢測原理
血清中存在的登革熱病毒抗體，與微孔測試條上聚苯乙烯表面附著的登革熱抗原結合物相結合。 洗去剩余的血清并添加過氧化物酶標記的抗人IgG抗體。清洗微孔，再添加無色的底物系統 - 四甲基聯苯胺/過氧化氫（TMB顯色液）。底物被酶水解后，顯色液變藍。用酸終止反應后，TMB變黃。顯色表示測試樣本中存在登革熱IgG抗體。
提供的材料
- 登革熱抗原（血清型1、2、3和4）包被微孔板-（12x8孔）。即用型。未使用的微孔應該立即重新密封并儲存于干燥環境中。有效期內儲存于2-8℃可保持穩定。
- 清洗緩沖液（20倍） - 1瓶，60mL 20倍濃縮磷酸鹽緩沖鹽水（pH 7.2 – 7.6），含吐溫 20和防腐劑（0.1% Proclin™）。低溫可能結晶。若去除結晶，可在37℃孵育液體至澄清。混合均勻。用19體積的蒸餾水稀釋1體積的清洗緩沖液。稀釋后的緩沖液可在2-25℃儲存一周。
- 樣本稀釋劑 – 2瓶， 50 mL（粉色）。即用型。Tris緩沖生理鹽水（pH 7.2 – 7.6），含防腐劑（0.1% Proclin™）和添加劑。有效期內儲存于2-8℃可保持穩定。
- HRP標記抗人IgG – 1瓶，15mL（綠色）。即用型。辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗人IgG，含防腐劑（0.1% Proclin™）和蛋白穩定劑。有效期內儲存于2-8℃可保持穩定。
- TMB顯色液（TMB） - 1瓶，15mL。即用型。3,3’,5,5'-四甲基聯苯胺和過氧化氫的混合物，存放于枸櫞酸鹽緩沖液中（pH 3.5 – 3.8）。有效期內儲存于2-8℃可保持穩定。
- 陽性質控品 – 1瓶，紅色瓶蓋，200μL人血清（含0.1%疊氮話鈉和0.005%硫酸慶大霉素）。有效期內儲存于2-8℃可保持穩定。
- 校準品 – 1瓶，黃色瓶蓋，850μL人血清（含0.1%疊氮話鈉和0.005%硫酸慶大霉素）。有效期內儲存于2-8℃可保持穩定。
- 陰性質控品 – 1瓶，綠色瓶蓋，200μL人血清（含0.1%疊氮話鈉和0.005%硫酸慶大霉素）。有效期內儲存于2-8℃可保持穩定。
- 終止液 – 1瓶，紅色瓶蓋，15mL。即用型。1M磷酸。有效期內儲存于2-25℃可保持穩定。
Proclin™ 300是Rohm 和Haas公司的注冊商標。
需要但未提供的材料
- 精確、可調節的微量移液器，含一次性吸液頭（5-1000 μL容積）
- 去離子水
- 標板清洗系統
- 酶標儀，含450nm濾波器
- 計時器
- 刻度量筒
- 燒瓶
- 試管或微滴定板，用于稀釋血清
注意事項
用于體外診斷
- 在制備質控品的過程中使用的所有人源性材料已經過人類免疫缺陷病毒1/2（HIV 1 /2）抗體、丙肝（HCV）和乙肝表面抗原的檢測，結果為陰性。但是，任何測試方法都不能*確信，且所有人源性質控品和抗原包被微孔板都應按照潛在傳染性材料處理。疾病控制和預防中心以及美國國立衛生研究院建議將潛在傳染原按照生物安全二級2處理。
- 該測試只能使用血清執行。尚未建立使用全血、血漿或其它標本基質的方法。
- 不可使用黃疸或脂血癥血清，以及出現溶血或微生物生長的血清。
- 不可加熱，否則血清將失去活性。
- 在開始檢測前所有試劑必須平衡至室溫（20-25℃）。檢測受溫度變化的影響。微孔板在達到室溫（20-25℃）之前不可從密封袋中取出。
- 直接用干凈的吸液頭從試劑瓶中吸出試劑。轉移試劑可能導致污染。
- 未使用的微孔應該立即重新密封并儲存于干燥環境中。否則將產生錯誤結果。
- 底物系統：
- 由于TMB易受金屬離子的污染，所以底物系統不能與金屬表面接觸。
- 避免長時間陽光直射。
- 有些清潔劑可干擾TMB的性能。
- TMB可能呈現淡藍色，這不影響底物的活性或測定結果。累積。
- 疊氮話鈉還抑制酶標物的活性。在添加酶標物時必須使用干凈的吸液頭，避免攜帶其它試劑的疊氮話鈉。
標本采集和制備
靜脈穿刺獲取的血液應該置于室溫（20-25℃）下直到凝塊形成，再按照臨床實驗室標準化研究院（CLSI）的《認可標準——診斷用血液標本的靜脈穿刺采集程序，H3》離心。應該盡快分離血清。如果在2天內不進行檢測，血清應該2-8℃冷藏或者低于或等于- 20℃冷凍儲存。不*使用自解凍冷凍機儲存血清。不*使用黃疸血清，以及出現溶血、脂血或微生物生長的血清。CLSI提供了儲存血液標本的建議，《認可標準——血液標本的處理加工程序，H18》。
檢測程序
注： 確保所有試劑在開始測定前平衡至室溫（20-25℃）。在所給時間和溫度范圍以外進行測試可能產生無效的結果。不在預定時間和溫度范圍內的測試必須進行重復。
ELISA程序
- 從鋁箔袋中取出所需數量的微孔板并插入測試條槽。陰性質控品、陽性質控品和校準品各需5個微孔，一式三份。確保剩下未使用的微孔密封于鋁箔袋內。
- 使用適當的試管或微滴定板稀釋陽性質控品（P）、陰性質控品（N）、校準品（CAL）和患者樣本。
- 混合10μL血清與1000μL樣本稀釋劑。混合均勻。
或者，
- 混合10μL血清與90μL樣本稀釋劑。取出20μL稀釋血清，加入180μL樣本稀釋劑。混合均勻。
- 吸取100 µL樣本稀釋劑、質控品和校準品添加至對應的微孔中。
- 蓋住測定板并在37°C ± 1°C孵育30分鐘。
- 用稀釋后的清洗緩沖液洗6次（參考清洗程序）。
- 吸取100 µL HRP標記抗人IgG添加到每個微孔中。
- 蓋住測定板并在37°C ± 1°C孵育30分鐘。
- 用稀釋后的清洗緩沖液洗6次（參考清洗程序）。
- 吸取100 µL TMB添加到每個孔中。
- 在室溫（20-25℃）下孵育10分鐘，從第①次添加開始計時。藍色將會顯現。
- 按照相同順序吸取100μL終止液添加到每個孔中，計時同TMB添加步驟。混合均勻。藍色將變成黃色。
- 在30分鐘內讀取每個孔在450nm波長的吸光度，參考濾波器為600-650nm。
注： 如果使用雙波長分光光度計，將參考濾波器設定在600-650nm之間。在沒有參考濾波器的情況下讀取450nm的微孔結果可能由于背景原因導致吸光度偏高。
清洗程序
為了清除未復合的樣本或成分，有效清洗是ELISA程序的關鍵步驟。
A.自動洗板機
- *抽凈所有微孔。
- 在清洗循環期間將每個孔裝滿至邊緣（350μL）。
- 完成6次清洗后，將測定板倒立于吸水紙巾上用力敲打，確保清除所有清洗緩沖液。
- 為了確保有效清洗，必須維持自動洗板機良好的保養。必須始終遵守廠商的清潔說明。
B.手動清洗
- 將測定板的內含物丟棄到適當的廢物容器。
- 用適當的擠壓瓶將微孔填滿清洗緩沖液。避免清洗緩沖液起泡，否則會降低清洗效率。立即丟棄微孔里的清洗緩沖液。
- 再將微孔填滿清洗緩沖液，并立即丟棄。
- 重復步驟（3）4次，共用清洗緩沖液清洗六（6）次。
- 后一次清洗完成后，丟棄微孔的內含物并將測定板置于吸水紙巾上敲打，以確保清除所有清洗緩沖液。
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