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基孔肯雅熱IgG抗體檢測(cè)試劑盒

【產(chǎn)品名稱(chēng)】

通用名稱(chēng)：基孔肯雅熱IgG檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）

英文名稱(chēng)：Chikungunya IgG micro-capture ELISA

【產(chǎn)品規(guī)格】

96T

【預(yù)期用途】

試劑盒可用于人血清和血漿（檸檬酸鹽）中基孔肯雅熱IgG抗體的定性檢測(cè)。

【前言簡(jiǎn)介】

基孔肯雅熱病毒是一種屬于披膜病毒科甲病毒屬的節(jié)肢動(dòng)物媒介病毒。披膜病毒科甲病毒屬（α-病毒屬）至少有24種不同的種屬。它們是一類(lèi)脂質(zhì)圍繞的病毒體，直徑約為50-60nm。

α-病毒感染初是由感染的蚊子叮咬引起的，感染后，病毒借機(jī)進(jìn)入皮下和皮膚組織。1至12天，演變?yōu)榛卓涎艧帷?/span>

基孔肯雅熱是一種急性病毒感染，以快速病變?yōu)樘卣鳎腥竞蠼】禒顟B(tài)迅速惡化產(chǎn)生疾病，包括嚴(yán)重的關(guān)節(jié)痛和發(fā)燒。

體溫會(huì)突然上升，可高達(dá)40℃，并伴有寒戰(zhàn)。幾天后，發(fā)燒癥狀減弱，繼而復(fù)發(fā)，這樣周而復(fù)始的類(lèi)似鞍狀峰狀曲線(xiàn) 體溫。關(guān)節(jié)痛主要表現(xiàn)在多關(guān)節(jié)，主要累及小關(guān)節(jié)區(qū)域的嚴(yán)重受損，隨運(yùn)動(dòng)增加，疼痛加劇。患者通常應(yīng)避免移動(dòng)。關(guān)節(jié)會(huì)腫脹，但無(wú)明顯關(guān)節(jié)液體積聚。這類(lèi)癥狀持續(xù)1周至數(shù)月并伴隨有肌痛。病發(fā)一天會(huì)出現(xiàn)皮疹，但也有延遲出現(xiàn)的，然后皮疹漫延至臉部，頸部，演變?yōu)榘哒睢⑶鹫罨蜃像?,疹間皮膚多為正常 ,伴有瘙癢感，繼而軀干、四肢的伸展側(cè)、手掌和足底出現(xiàn)皮疹。也能觀(guān)察到瘀斑皮膚受損。頭痛，畏光，有明顯咽炎，惡心，嘔吐的咽喉痛也是病發(fā)可能出現(xiàn)的癥狀。很多情況下，關(guān)節(jié)痛和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎會(huì)持續(xù)數(shù)月仍至數(shù)年，常伴有關(guān)節(jié)受損，更有罕見(jiàn)者，出現(xiàn)包括腦炎，高致命性腦膜腦炎的后遺癥。

這類(lèi)病毒在非洲和亞洲為高發(fā)區(qū)。20%至90%熱帶和亞熱區(qū)人群發(fā)現(xiàn)有感染的血清學(xué)證據(jù)。由于伊蚊在北非和南美急劇橫行，這些地帶的人群對(duì)病毒都有易感性，因此造成爆發(fā)疫情的可能性。中歐人群的感染主要是因?yàn)橐恍┰竭^(guò)熱帶和亞熱帶的旅行者攜帶基孔肯雅熱病毒而傳染的。

病毒感染可由以下方法鑒別

• 血清學(xué)： 免疫熒光、酶免法檢測(cè)相應(yīng)的抗體

【檢測(cè)原理】

試劑盒采用酶聯(lián)免疫法。微孔中預(yù)包被有抗人IgG，用于結(jié)合樣品中相應(yīng)的抗體。洗板后，去除非結(jié)合的樣品。再加入基孔肯雅熱抗原液，再次洗板后，再加入生物素化的基孔肯雅熱抗體。加入鏈霉親和素標(biāo)記結(jié)合物（酶聯(lián)物），與固相的特異性的基孔肯雅熱復(fù)合物結(jié)合。加入TMB底物液后，微孔中顯藍(lán)色。顯色的強(qiáng)度與病人樣品中基孔肯雅熱IgG抗體的量成正比。加入終止液終止酶反應(yīng)，形成黃色終點(diǎn)產(chǎn)物。后在酶標(biāo)儀處450 nm讀數(shù)。

【試劑盒組成成分】

微孔板            12×8

包被有抗人IgG

樣品稀釋液        1×100 mL

即用型、pH7.2±0.2、黃色、白蓋

洗滌液            1×50ml

20倍濃縮、pH7.2±0.2、白蓋

基孔肯雅熱抗原液  6瓶

凍干品、紅蓋

基孔肯雅熱抗體液  1×6ml

含生物素化基孔肯雅熱抗體、即用型、藍(lán)色、白蓋

鏈霉親和素酶聯(lián)物  1×6ml

含鏈霉親和素標(biāo)記的HRP、即用型、紅色、黑蓋

終止液            1×15ml

即用型、含硫酸、濃度0.2mol/L、紅蓋

底物液            1×15ml

即用型、黃蓋

陽(yáng)性質(zhì)控          1×1.5ml

即用型、黃色、紅蓋

臨界質(zhì)控          1×2ml

即用型、黃色、綠蓋

陰性質(zhì)控          1×1.5ml

即用型、黃色、藍(lán)蓋

封板紙

支架

所需材料（未提供）

·酶標(biāo)儀（450/620 nm）

·恒溫箱（37 ℃）

·洗瓶或自動(dòng)洗板機(jī)

·移液管（規(guī)格10和1000 µL）

·震蕩器

·去離子水或蒸餾水

·一次性試管

·計(jì)時(shí)器

【儲(chǔ)存條件】

試劑盒存于2~8℃，能穩(wěn)定保存至有效期，有效期見(jiàn)標(biāo)簽 。

【樣品要求】

試驗(yàn)采用人血清或血漿（檸檬酸鹽）。收集的樣品在2~8℃可保存5天。更長(zhǎng)時(shí)間，分成小份，凍存于（-20~-70℃）。 凍存樣品，試驗(yàn)前應(yīng)*解凍。避免反復(fù)凍融。

不建議使用熱滅活樣品

樣品稀釋

試驗(yàn)前樣品應(yīng)稀釋?zhuān)?個(gè)單位的樣品+100個(gè)單位的樣品稀釋液，如10µL樣品+1mL樣品稀釋液，在試管中旋渦搖勻。

【檢測(cè)方法】

試劑準(zhǔn)備

試驗(yàn)前，將所有試劑，樣品，質(zhì)控品平衡至室溫(20~25℃)

基孔肯雅熱抗原：

每瓶加入1mL稀釋洗滌液溶解，緩慢加入，室溫下靜置溫育15min，制成即用型抗原液。此抗原液在2~8 ℃可穩(wěn)定保存1天。

洗滌液：

1個(gè)單位的濃縮洗滌液+19個(gè)單位的雙蒸水。

如：10mL濃縮洗滌液+190 mL雙蒸水。稀釋洗滌液在室溫下能穩(wěn)定保存5天。開(kāi)瓶后，濃縮的洗滌液在2~8℃可穩(wěn)定保存至有效期.

檢測(cè)步驟

試驗(yàn)前，仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。嚴(yán)格執(zhí)行說(shuō)明書(shū)要求才能得到優(yōu)良結(jié)果。如試驗(yàn)使用自動(dòng)洗板機(jī)，建議每孔350µL，洗板5次（如手工洗，則每孔300µL，洗板3次）。試驗(yàn)前，確定好樣品，質(zhì)控品的加樣布局方案。取所需板條置于板架上。

至少設(shè)

1孔（如A1）         空白對(duì)照

1孔 (如B1)          陰性質(zhì)控

2孔 (如C1+D1）      臨界質(zhì)控

1孔（如E1）         陽(yáng)性質(zhì)控

如覺(jué)得有必要，建議樣品和質(zhì)控品都作雙份檢測(cè)。

試驗(yàn)應(yīng)按同樣的加樣順序加取試劑，避免不同的時(shí)間間隔造成誤差。

使用新的一次性加樣槍頭，加各質(zhì)控品，樣品

調(diào)節(jié)恒溫箱為37±1℃

• 加50µL質(zhì)控品和稀釋樣品至相應(yīng)各孔中，設(shè)A1作為空白對(duì)照
• 封板紙蓋板
• 37 ± 1 ℃溫育1小時(shí)±5分鐘
• 溫育后，移除封板紙，倒出微孔內(nèi)液體，每孔用300µL稀釋洗滌液，洗板3次，避免洗滌液相互溢濺至其它微孔。每次洗板時(shí)，浸泡時(shí)間應(yīng)大于5秒。后，在吸水紙上拍干，去除殘留液滴。

注意：洗滌步驟很關(guān)鍵。不充分的洗板，會(huì)導(dǎo)致不精確或錯(cuò)誤上升的吸光度值。

• 除空白對(duì)照孔（A1）外，加50µL基孔肯雅熱液抗原液至各孔，蓋板
• 室溫下溫育30分鐘
• 重復(fù)步驟4
• 除空白對(duì)照孔（A1）外，加50µL 基孔肯雅熱液抗體液至各孔，蓋板
• 室溫下溫育30分鐘
• 重復(fù)步驟4
• 除空白對(duì)照孔（A1）外，各加50µL鏈酶親和素酶聯(lián)物至各孔，蓋板
• 室溫下溫育30分鐘
• 重復(fù)步驟4
• 加100 µL TMB底物液至各孔中
• 黑暗處，精確溫育15分鐘
• 按加TMB底物液的順序和速度，加100 µL終止液至各孔中。

藍(lán)色溶液在孵育過(guò)程中變?yōu)辄S色。

注意：強(qiáng)陽(yáng)性樣品會(huì)導(dǎo)致色原產(chǎn)生沉淀，沉淀的產(chǎn)生會(huì)對(duì)讀數(shù)產(chǎn)生影響。所以先用陰性基質(zhì)進(jìn)行預(yù)稀釋?zhuān)ㄗh1：1的比例稀釋?zhuān)缓螅?個(gè)單位的預(yù)稀釋樣品+100個(gè)單位的樣品稀釋液。終結(jié)果（以U計(jì)算）乘以預(yù)稀釋因子2即可

• 加入終止液后，30分鐘內(nèi)，在酶標(biāo)儀450/620 nm處讀數(shù)

【結(jié)果計(jì)算】

用A1空白對(duì)照孔對(duì)酶標(biāo)儀進(jìn)行調(diào)零

如遇技術(shù)問(wèn)題，酶標(biāo)儀不能調(diào)零。 所測(cè)樣品的吸光度值減去空白對(duì)照的讀數(shù)值，

即可得到較可靠的讀數(shù)。

在酶標(biāo)儀處450 nm處測(cè)讀所有質(zhì)控品和樣品的吸光度值。620 nm作為參考波長(zhǎng)。

如進(jìn)行雙孔檢測(cè)，計(jì)算吸光度均值。

實(shí)驗(yàn)有效性標(biāo)準(zhǔn)

如試驗(yàn)有效，必須滿(mǎn)足以下要求

·空白對(duì)照（A1）：       吸光度值<  0.100

·陰性質(zhì)控（B1）：       吸光度值<  臨界讀數(shù)

·臨界質(zhì)控（C1+D1）     吸光度值   0.150~1.300

·陽(yáng)性質(zhì)控（E1）        吸光度值>  臨界讀數(shù)

如上述標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)滿(mǎn)足，試驗(yàn)視為無(wú)效，試驗(yàn)應(yīng)重測(cè)。

結(jié)果計(jì)算

臨界讀數(shù)是雙孔臨界質(zhì)控的吸光度均值

示范： 臨界吸光度值0.39 +臨界吸光度值0.37＝0.76 / 2 = 0.38

即吸光度值＝0.38

結(jié)果分析說(shuō)明

樣品吸光度值高于臨界讀數(shù)的10 %視為陽(yáng)性結(jié)果。

樣品吸光度值在臨界讀數(shù)的±10 %范圍內(nèi)視為灰色可疑區(qū)

建議2－4周后，重新取新鮮的樣品進(jìn)行試驗(yàn)。如試驗(yàn)結(jié)果仍為灰色可疑區(qū)，視

為陰性結(jié)果

樣品吸光度值低于臨界讀數(shù)的10%視為陰性結(jié)果

結(jié)果以U表示

病人吸光度均值×10        

--―――――――  ＝ [Units=U]

臨界指數(shù)

示范： 1.216×10   

       -------------   =32 U（Units）

         0.38

臨界：    10 U

灰區(qū)：    9-11 U

陰性：    <9 U

陽(yáng)性：    >11 U

【注意事項(xiàng)】

• 試劑僅供體外診斷和專(zhuān)業(yè)人士使用。
• 在檢測(cè)開(kāi)始之前，仔細(xì)和完整的閱讀說(shuō)明書(shū)，使用試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)的有效版本，確保所有的程序都清楚。
• 如果試劑盒有破壞的請(qǐng)與IBL公司聯(lián)系或是提交您的投訴單，但自您拿到試劑盒后遲不超過(guò)一個(gè)星期。在檢測(cè)時(shí)請(qǐng)不要使用受損的試劑，并妥善保管好以備投訴時(shí)使用。
• 按照批號(hào)和有效期，不要混合使用不同批號(hào)的試劑，也不要使用過(guò)期的試劑。
• 遵守實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化管理規(guī)則和安全指南，穿實(shí)驗(yàn)服，帶橡皮手套，有必要時(shí)請(qǐng)戴護(hù)目鏡。
• 這種試劑盒中含有會(huì)傷害眼睛和皮膚的有害試劑，請(qǐng)閱讀材料來(lái)源和標(biāo)簽獲取詳細(xì)信息。產(chǎn)品的材料安全數(shù)據(jù)能夠從IBL公司主頁(yè)上載可直接咨詢(xún)IBL公司獲取。
• 根據(jù)國(guó)家生物有害物質(zhì)及安全條例，所有化學(xué)藥品和準(zhǔn)備或使用過(guò)的試劑都應(yīng)當(dāng)做有害物質(zhì)進(jìn)行處理。
• 避免接觸終止液，以免刺激或灼燒皮膚。
• 試劑盒中部分試劑含有疊*化鈉作為防腐劑，一旦與皮膚或者眼睛發(fā)生接觸，立即用大量清水沖洗. *氮化鈉可能會(huì)與鉛和銅的管道發(fā)生反應(yīng)，形成爆炸性的金屬疊氮化物。當(dāng)處理試劑時(shí)，使用大量水沖洗以防止疊氮化物的形成。
• 試劑盒中的所有試劑包括檢測(cè)過(guò)的人血清/血漿對(duì)HIV/II，HbsAg和HCV都表現(xiàn)為陰性，但是試劑中會(huì)出現(xiàn)此類(lèi)病毒（HIV/II，HbsAg和HCV）或其他具有感染性的病原體的可能性都不能*被排除。因此，所有的試劑在使用和處理的過(guò)程中都應(yīng)當(dāng)作潛在生物有害物質(zhì)進(jìn)行處理。

操作注意事項(xiàng)

1. 樣品的不合理處理及實(shí)驗(yàn)操作的任何改動(dòng)都將影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。取樣體積、溫育時(shí)間、預(yù)處理步驟都必須嚴(yán)格按說(shuō)明進(jìn)行。只能使用標(biāo)準(zhǔn)取樣器和標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備。

2. 一旦實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，所有的步驟都必須完整的進(jìn)行下去，不允許中斷。在使用前，將所有試劑和樣品都平衡至室溫（18-25℃），輕輕搖動(dòng)液體試劑和樣品，試劑混合過(guò)程中要避免氣泡。

3. 避免污染試劑、取樣器、微孔/試管。加試劑和樣本時(shí)，請(qǐng)使用新的取樣吸頭。不要交換瓶蓋。蓋好不使用的試劑。不要重復(fù)使用微孔/試管或者試劑。

4. 用定標(biāo)儀對(duì)反應(yīng)板進(jìn)行校準(zhǔn)。

5. 溫育時(shí)間會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。微孔加樣的順序和時(shí)間都必須*。建議使用8孔微量取樣器給微孔加樣。

6. 微量板的清洗非常重要，微孔清洗不好將會(huì)形成錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。建議使用多孔取樣器或自動(dòng)微孔清洗設(shè)備進(jìn)行清洗。每次溫育間隔期間要避免微孔干燥。加洗滌液和吸液時(shí)要避免碰到包被孔。清洗和加試劑時(shí)都應(yīng)特別小心。清洗時(shí)，在微孔中精確的加入洗滌液緩沖液，同時(shí)確保微孔中無(wú)殘?jiān)?/span>

7. 濕度會(huì)影響包被板，所以在未到達(dá)室溫時(shí)請(qǐng)勿打開(kāi)包裝，未使用的包被板要重新密封于裝有干燥劑的包裝袋中。             

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